PCR alias Polymerase Chain Reaction adalah salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler. Dengan PCR, DNA dalam jumlah yang sangat sedikit dapat kita lipatgandakan untuk selanjutya diidentifikasi, dimanipulasi dan bisa pula digunakan untuk keperluan forensik, diagnosis virus penyakit dan sebagainya.
Selain enzim Taq DNA Polymerase yang menjadi kunci pokok teknik PCR, ada satu komponen lagi yang tak kalah pentingnya, yaitu Primer PCR. Spesifisitas dan efisiensi PCR amat ditentukan oleh kualitas primer yang digunakan. Sekarang yuk kita bahas bagaimana caranya mendesain primer untuk PCR.
Selain enzim Taq DNA Polymerase yang menjadi kunci pokok teknik PCR, ada satu komponen lagi yang tak kalah pentingnya, yaitu Primer PCR. Spesifisitas dan efisiensi PCR amat ditentukan oleh kualitas primer yang digunakan. Sekarang yuk kita bahas bagaimana caranya mendesain primer untuk PCR.
Apa itu Primer?
Sebelum melangkah lebih jauh, kita lihat dulu pengertian primer. Primer itu tak lebih dari sepotong DNA pendek utas tunggal atau lebih dikenal dengan oligonukleotida, panjangnya antara 10 sampai sekitar 40 basa saja. Primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi polimerisasi DNA secara in vitro, karena tanpa primer, reaksi polimerisasi DNA tidak akan terjadi meskipun enzim dan komponen lainnya sudah tersedia. Selain itu primer juga berfungsi untuk membatasi daerah mana yang akan diamplifikasi pada reaksi PCR. Karena berbeda dengan proses penggandaan DNA di dalam sel yang mengkopi seluruh DNA genom secara utuh, pada PCR kita hanya dapat mengamplifikasi daerah tertentu saja dengan ukuran hingga sekitar 10.000 basa. Untuk menyegarkan ingatan kita tentang PCR, silakan lihat video di bawah ini atau klik di sini.
Karena fungsi primer sebagai inisiator sekaligus pembatas daerah yang akan diamplifikasi, maka idealnya primer memiliki urutan basa nukleotida yang tepat berpasangan dengan urutan basa DNA target yang akan diamplifikasi, dan tidak menempel di bagian lainnya.
Nah, di sini desain primer yang bagus merupakan hal esensial bagi keberhasilan reaksi PCR. Memang sulit untuk membuat primer yang ideal, namun sedapat mungkin kita memperoleh keseimbangan antara spesifisitas dan efisiensi. Spesifisitas didefiniskan sebagai frekuensi terjadinya mispriming (kesalahan penempelan) primer pada tempat yang tidak seharusnya. Primer dengan spesifisitas buruk akan terlihat dari banyaknya pita-pita yang tidak diinginkan saat produk PCR divisualisasi dengan elektroforesis gel. Sedangkan efisiensi adalah seberapa dekat perolehan jumlah produk PCR dengan nilai teoritis yang seharusnya dicapai (ingat bahwa setelah N siklus PCR maka akan dihasilkan 2N kopi produk).
Untuk lebih jelas mengenai parameter apa saja yang harus diperhatikan dalam mendesain primer, silakan klik di sini. Berikutnya kita akan bahas tahap-tahap dalam mendesain primer.
1. Tentukan Tujuan
Untuk apa primer yang akan kita desain? Untuk mengamplifikasi gen universal seperti gen 16S ribosomal RNA bakteri? Mendeteksi keberadaan suatu virus penyakit tertentu? Walking primer untuk analisa DNA sequencing fragment yang panjang? Atau untuk tujuan lainnya? Setelah kita menentukan tujuan, barulah kita bisa menentukan langkah selanjutnya dengan lebih baik.
Oke, kita ambil contoh desain primer untuk mendeteksi keberadaan virus penyakit Tobacco Mosaic Virus(TMV) yang menyerang tanaman tembakau dan tumbuhan golongan Solanaceae misalnya.
2. Menyiapkan Sekuen Referensi
Karena targetnya adalah virus TMV, maka tentu saja kita harus mengumpulkan sekuen TMV sebagai referensi. Usahakan agar pencarian kita lebih spesifik dengan cara menentukan gen targetnya. Kita bisa mencari sekuen referensi dari database GenBank di situs NCBI. Ketikkan “Tobacco Mosaic Virus” sebagai kata kunci pencarian.
Berapa sekuen referensi yang kita perlukan? Satu, dua atau sebanyak mungkin? Sebetulnya 1 sekuen sudah bisa kita jadikan referensi asalkan kita yakin bahwa sampel target kita nantinya memiliki kesamaan spesies atau dengan kata lain secara genetik sangat mirip. Namun jika kita bisa memperoleh banyak sekuen tentu akan lebih baik agar kita dapat mendesain primer di daerah yang benar-benar sama (conserved region) setelah sekuen tersebut disejajarkan (alignment).
Jika Anda mengalami kesulitan dalam mencari sekuen TMV di GenBank silakan buka artikel kami tentang GenBank di sini.
3. Manual atau perlu bantuan software?
Pada dasarnya kita bisa sembarang mengambil daerah tertentu pada sekuen referensi untuk kita jadikan primer, tanpa perlu bantuan software khusus. Namun cara ini amat berisiko karena kita tidak mengetahui bagaimana kualitas primer kita nantinya. Sebab ada beberapa parameter yang harus kita perhatikan dalam mendesain primer.
Ada beberapa software yang bisa membantu kita, ada yang free dan ada juga yang berbayar, ada yangonline dan ada juga yang harus diinstall di komputer kita. Fiturnya pun bermacam-macam. Kalau sebelumnya kita sudah membahas cara mendesain primer menggunakan software PerlPrimer, maka pada kesempatan ini kita coba lagi software lain yang free dan tersedia secara online yaitu Primer3Plusdi situs http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi .
Tampilan Primer3Plus sangat sederhana, namun kemampuannya sudah teruji dan digunakan oleh banyak peneliti di seluruh dunia.
4. Siap mendesain primer
Bagaimana caranya? Simple kok, hanya beberapa langkah saja
Tampilan Primer3Plus
- Pada kotak yang tersedia, masukkan sekuen referensi Anda. Anda bisa juga mengunggah (upload) sekuen dari file di komputer.
- Pilih jenis primer yang ingin Anda desain, sense primer (left primer), antisense (right primer) dan probe untuk hibridisasi (internal oligo). Kotak yang ada di bawahnya bisa diisi jika Anda sudah memiliki kandidat primer.
- Tentukan beberapa parameter lain jika diperlukan seperti excluded region (daerah dimana primer tidak boleh menempel di situ), targets (primer harus mengapit daerah tersebut) dan included region(kedua primer harus berada di dalam daerah ini).
- Beberapa opsi yang lebih mendalam bisa kita tambahkan pula pada tab General Settings, Advance Settings, Internal Oligo, Penalty Weights dan Sequence Quality. Namun untuk saat ini kita biarkan dalam pilihan defaultnya.
- Jika semua opsi sudah terisi, tekan tombol PICK PRIMERS untuk memulai pencarian primer yang terbaik.
Hasil pencarian akan muncul pada laman selanjutnya. Di sana tertera beberapa hal mengenai primer kita, yaitu:
Hasil Pencarian Primer dengan Primer3Plus
- Primer3Plus akan memberikan beberapa alternatif pasangan primer yang dapat kita pilih. Pada gambar di atas terlihat pasangan primer pertama.
- Nama Left Primer dan Right Primer
- Sekuen kedua primer
- Posisi primer pada sekuen referensi, panjang primer, Titik Leleh (Tm), % GC dan beberapa parameter terkait struktur sekunder yang mungkin terjadi.
- Ukuran produk PCR
5. Menguji spesifisitas primer
Primer yang baru saja kita desain harus diuji spesifisitasnya agar kita yakin bahwa mereka akan mengamplifikasi target yang kita inginkan. Pengujian spesifisitas dapat dilakukan dengan bantuan BLAST di NCBI. Bagaimana cara menguji spesifisitas primer dapat dilihat pada artikel kami yang berjudulMenguji Spesifisitas Primer.
Bagaimana? Mudah bukan? Jika Anda memiliki komentar, saran dan tips-tips khusus seputar desain primer silakan utarakan di kotak comments di bawah.
sumber
Tidak ada komentar:
Posting Komentar